X の新しい定量的ターゲット分析

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12856 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

X 染色体不活化 (XCI) 分析は、X 関連形質の診断に役立つことがよくありますが、現在の方法では正確な評価が依然として困難です。私たちは、ヒトアンドロゲン受容体遺伝子 (AR) およびヒト X 連鎖網膜色素変性症 2 遺伝子 (RP2) における XCI を調査し、厳密に定量するために、増幅を必要としない Cas9 濃縮と XCI-ONT と呼ばれるオックスフォードナノポア技術シーケンスを使用した新しい戦略を開発しました。 XCI-ONT は、AR の 116 CpG と RP2 の 58 CpG のメチル化を測定し、PCR バイアスなしで親 X 染色体を分離します。我々は、遺伝子ごとに 1 つまたは 2 つの CpG のみを調査する PCR ベースの黄金標準 XCI 手法よりも、XCI-ONT 戦略の有用性を示します。この結果は、XCI パターンが部分的に歪んでいる場合に黄金標準手法を使用することの限界と、XCI を厳密に定量化する XCI-ONT の利点を強調しています。この研究は、DNA に対する普遍的な XCI メソッドを提供します。これは、X 連鎖形質の臨床および研究の枠組みにおいて非常に価値があります。

X 染色体不活化 (XCI) は、男性 (46XY)、女性 (46XX)、および X 異数性を持つ個人間の X 染色体の数の違いを補償するメカニズムです1。ヒトの分子 XCI 機構は完全には理解されていません 2,3 が、XCI は、X 不活性特異的転写産物 (XIST) の遺伝子発現を含む X 不活化中心 (Xic) のシス作用性因子およびトランス作用性因子によって制御されていることが研究によって示されています。および X 活性特異的転写産物 (XACT) 遺伝子 3。これは最終的に、単一対立遺伝子の発現、H3K27me33 の蓄積、および不活性 X 染色体 (Xi) 上の遺伝子のプロモーター近くの CpG 部位のメチル化につながります (図 1A)。メチル化は習氏の不活性状態の維持に重要であることが示されている7、8、9、10。ヒトにおける XCI は初期の胚着床段階で始まり 3、どの X 染色体を不活化するかの選択は一般にランダムなプロセスとして説明され、両方の X 染色体が同等に存在します 11,12。しかし、1 本の X 染色体の優先的な不活化、いわゆるスキュード XCI は、キャリア女性の X 関連疾患の症状を変化させることが観察されており、遺伝子型が活性 X 染色体 (Xa) の選択において重要であることを示しています。変異細胞の不利な点による細胞選択13、14、15、16。第一に、病原性対立遺伝子の優先的なサイレンシングは、雌の選択的生存、または X 連鎖形質の影響の軽度化と関連している。極端な偏りは、保因者女性における病原性 X 連鎖バリアントの存在の良い指標であることが示されており 15、17、18、したがって、家族親戚における XCI 分析は、X 連鎖バリアントの解釈に役立つことがよくあります。第二に、病原性対立遺伝子の発現は、X 連鎖形質の保因者女性における表現型の発現につながる可能性があり 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 、影響を受けた保因者女性と感染した保因者女性で観察される表現型の違いを説明できる可能性があります。 X異数性を持つ個人21、24、29、30、31、32、33、34、35、36。注目すべきことに、XCI 分析は、関連する組織、さまざまな年齢、非喫煙者で実施することが推奨されています 37、38、39、40、41、42、43、44。一般に、スキューの定義は > 80:20 ですが、XCI 分析に使用される黄金標準技術の制限により、スキューの定量化は 100:0 サイレンシング以外では推奨されておらず、定量的手法の必要性が強調されています。。

(A) X 染色体不活化機構と X 染色体関連形質のキャリア女性におけるその影響の概略図。青: 活性型 X 染色体 (Xa)、赤: 不活性型 X 染色体 (Xi)、黄色の星: 病原性 X 連鎖変異体。 Adobe illustrator 2022 (https://adobe.com/products/illustrator で入手可能) を使用して作成されたイラスト。 (B) 黄金標準の XCI メソッドでは、Xa を切断し、Xi をそのまま残すメチル化感受性制限酵素 (HpaII) を使用します。 HpaII は、アンドロゲン受容体 (AR) と網膜色素変性 2 (RP2) のそれぞれ 2 つと 1 つの CpG 部位を標的にし、続いて PCR と、親対立遺伝子を分離する多型反復領域 (CAGn または GAAAn) にわたるフラグメント長解析 (FLA) が行われます。 Adobe Illustrator 2022 (https://adobe.com/products/illustrator で入手可能) を使用して作成されたイラスト。 XCI-ONT アプローチは、AR の 116 CpG 部位と RP2 の 58 CpG 部位にわたる約 3 kb の対象領域 (ROI) に隣接する 3 つの gRNA (ピンク) による CRISPR-Cas9 濃縮を使用して、メチル化状態とは独立して DNA を切断します。 (C) XCI-ONT には以下が含まれます: (1) オフターゲット鎖への配列決定アダプターのライゲーションを減らすための 5' 末端の脱リン酸化。 (2) CRISPR-Cas9 システムが ROI に結合して切断し、DNA は、3' dA テールと 5' リン酸化の両方である Cas9 切断側へのアダプターライゲーションのために dA テール化されます。 (3) ライブラリーは、Oxford Nanopore Technologies および Bonito 塩基コーリングを使用して配列決定されます。（４）領域内のすべての可能なリピートを含む参照ゲノムにリードを位置合わせすることによってリピートを呼び出し、異なるリピートを有するリードの数をプロットすることによってリードをハプロタイプに分割する。最後に、Nanopolish を使用してメチル化の呼び出しと定量化が実行され、Integrative Genomics Viewer (IGV) を使用してデータが視覚化されます。 ROI の平均メチル化が計算され、2 つの X 染色体の XCI 比が決定されます。

80:20), often used in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be very useful when XCI is modifying disease e.g. in the investigation of carrier females presenting symptoms due to expression of the pathogenic allele (incomplete silencing). Approaches for quantifying the levels of XCI on the maternal and paternal allele have been proposed before but this requires either bisulfite conversion and PCR50 or paired RNA and DNA sequencing data of the XIST gene using informative transcribed heterozygous single nucleotide variants (SNVs) to separate the parental alleles41,51. A SNV is not as informative as repeated elements and can therefore not be used to distinguish between individuals. This highlights the need for a universal quantitative XCI analysis on DNA to be used for research applications and clinical diagnostics related to X-linked traits./p> T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) where carrier females had ~ 100:0 skewed XCI when investigating the AR gene57. The XCI result was confirmed in this study by investigating the RP2 locus of two asymptomatic carrier females (IV:8, III:10) and one asymptomatic non-carrier female (III:7) (Supplementary Fig. 1). The two asymptomatic carrier females presented a ~ 100:0 skewed XCI status consistent with the maternal X-chromosome being silent (carrying the pathogenic variant). The asymptomatic non-carrier female had expression of both alleles i.e. a random XCI status, however the method presents variable result between experiments and contrasting results in the different genes (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). In addition, three females (female I, II and III) were investigated using the golden standard method. All individuals showed different ratios of XCI for both AR (female I 62:38, female II 47:53 and female III 81:19) and RP2 (female I 81:19, female II 60:40 and female III 87:13) (Table 1, Supplementary Fig. 2)./p> 80:20), often assisting in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be highly useful in the investigation of carrier females manifesting symptoms due to expression of the pathogenic allele. Quantification of XCI can illuminate the mechanism of disease, and provide useful information for improving prenatal risk assessment36, diagnostics and treatment development of X-linked traits. Lastly, we would like to illuminate the possibility that different disorders and pathogenic variants requires different levels of expression to develop symptoms and stress the use of a quantitative XCI investigation to answer these questions. A related application for XCI-ONT is monitoring pharmacological Xi reactivation, which has been suggested as treatment for X-linked disorders due to skewed XCI59,60,61,62./p> T;p.(Arg1190Cys) variant in the TAF1 gene (NM_004606.4)57. DNA from two carrier females (III:10, IV:8) and one non-carrier female (III:7) as well as three unrelated females (female I-III) was included in the current analysis./p> 20). The data were visualized by plotting the number of reads (y-axis) containing any repeat in the range of 5–40 repeats in AR or 5–30 repeats in RP2 (x-axis) (Supplementary Fig. 3). The reads were divided into haplotypes based on the repeat count and comparison with the golden standard results. Methylation calling and calculation of the methylation frequency was performed using Nanopolish software package (version 0.12.0). Only sites with a log-likelihood ratio > 2.5 (methylated) or < − 2.5 (unmethylated) were included in the methylation analysis (Supplementary Fig. 5). Bam-files were converted using the “converting bam for igv” package66 and the methylation status was visualized using Integrative Genomics Viewer bisulfite mode CG (version 2.10.0). The XCI status was established by using the average methylation frequency in the chrX:67543761–67546170 region (AR gene, 116 CpG sites, hg38) and chrX:46836539–46837273 region (RP2 gene, 58 CpG sites, hg38) followed by calculating the ratio of the average methylation between the alleles in each gene./p>

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